감자배지

 

버섯 종균 기능사 실기에서 가장 큰 비중을 차지한다는 원균분리, 배지제조, 계대배양을

한번에 연습해 보았습니다.

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-배지제조

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교재에는 감자배지 제조법이 나오지요.

감자 200g을 껍질과 눈을 잘 제거하고 1센티미터(어떤 교재엔 5mm) 사각썰기를 해서

물 1L에 20~30분간 약한불에 끓이고, 거즈로 걸러서 거른 액에 설탕 20g, 한천 20g을 넣고

1L가 되도록 물을 보충한 후 다시 끓여서 한천이 완전히 녹도록하고

분주기를 이용하여 시험관 1개당 10~15ml 되도록 분주하고 솜마개(면전)하거나

실리스토퍼(실리콘마개)로 막고

고압살균기에 넣고 121도, 20분 살균하고 15도 눕혀서 배지 굳히기.

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또는 2L짜리 삼각플라스크에 넣어서 고압살균기에 넣어 살균하고

꺼내어 무균상내에서 페트리디쉬에 1개당 20ml가 되도록 분주하고 굳히기.

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감자로 직접 배지를 만들기보다는 PDA라고 감자완성배지가 가루로 다 되어 있어서

그냥 가루넣고 끓이기만 하면 된다고 합니다.

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삼각플라스크에 PDA 39g을(40g이내) 저울에 달아서 넣고, 증류수 1L를 메스플라스크로

잰 후 삼각플라스크에 붓고 시약스푼으로 저어서 전자레인지에 넣고 또는 끓여서

시험관에 분주하고 면전해서 고압살균기에서 살균하고 꺼내기.​

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또는 삼각플라스크에 붓고 고압살균기에 넣어 살균하고 꺼내어 페트리디쉬 또는

멸균된 시험관에 분주하기

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일단 채점의 핵심은

유산지 사용 5점,

메스실린더 눈금 정확히 맞추기 5점,

시약스푼으로 저어주기 7점,

피펫을 사용하여 15~20ml 시험관에 분주하기 ​7점.

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실기시험을 보기 전에!

실험복을 입어요.

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소매는 팔꿈치까지 걷어주시구요.​

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저울, 배지, 메스플라스크, 비이커(또는 삼각플라스크), 시약스푼, 유산지.

 

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일단 전원을 켜기전에 수평이 맞는지부터 확인합니다.

보면 공기방울이 빨간 동그라미 안에 안들어가 있지요.

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수평맞추는 것 아래에 보면 저울의 다리 2개가 나사로 되어 있습니다.

(저울의 종류에 따라 수평계가 뒤쪽에 있으면 뒷다리 2개)

그걸 돌려서 공기방울이 동그라미 안에 들어가게 하면 됩니다.

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이렇게요. 양쪽 다리를 다 돌리면 헤깔리니.. 한쪽만 조이거나 풀어서 높이를 조절해주면

공기방울 움직이는 방향이 보이니 맞추기 쉽습니다.

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그런다음 저울의 전원을 켭니다.​

ON/OFF 또는 전원이라고 써있는 버튼을 누르면 됩니다.

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그리고 유산지를 올려요.

유산지가 안접혀 있으면 양끝 꼭지점을 맞닿게 접어서 + 모양을 만들면 됩니다.

유산지를 올린 후 영점맞추기를 해 줍니다.

REZERO 또는 TARE 또는 영점이라고 쓰인 버튼을 누르면 됩니다.

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그럼 유산지가 올라간채로 이렇게 0점이 맞게 됩니다.​

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거기에 PDA배지를 39g을 재어서 비이커(또는 삼각플라스크)에 넣어줍니다.

참고로 저는 로즈 벵갈 배지를 썼어요... 저희 실험실엔 이것뿐이라서...ㅠ

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이건 또 다른날 연습했던.. 배지입니다.

39g정도 달면 됩니다. 교재에는 40g 이내라고 되어있으니까요.

(물 1L 기준)

유산지를 잡을 때에는 종이 양끝을 모아서 잡으면 편해요.

조신하게 비이커나 삼각플라스크에 넣어줍니다.

 

 

다른 날 연습했던 사진입니다. 삼각플라스크에 넣어주었어요.

그런 다음 저울에 흘린 배지가 없는지 확인하고(지지한건 휴지로 닦아주세요)

전원을 꺼줍니다.

(뒷정리 점수를 잊지맙시다!)

그리고 물 1L를 부어주는데, 저는 이번에는 양을 적게 만들기 위해

1/4로 양을 줄여서 물을 250ml만 따랐습니다.

메스실린더 눈금을 확인할때에는 눈높이를 눈금에 맞춰서 무릎을 구부리고

(메스실린더를 눈높이로 들면 앙대요~)

쳐다보면서 물을 부어줍니다.

물의 아래쪽 면(메니스커스)이 눈금에 맞으면 된겁니다.

 

 

이건 지난날..ㅋㅋ 2가지 버전으로 글을 쓰니 더 헤깔리실지도 모르겠네요..

1L 즉 1000ml로 실험했던 사진입니다.

저 연습한다고 겁니 많이 만들고ㅠ 다 버리니 느므 아까웠어요..흑흑흑...

시약스푼으로 배지를 잘 저어주고(저어주는게 따로 배점이 있으니까요!)

전자레인지에 돌려줍니다.

채점표에 전자레인지가 언급이 되어있어서요.

교재에는 끓여준다라고 되어있는데 말이죠.

그럼 얼마나 끓여야 하는가는 배지의 양에 따라 다르다고 하네요ㅠ

적당히 봐서 배지가 팔팔 끓어오르면 멈추면 된다고 합니다.

저는 저만큼 돌리는데, 3분정도 걸렸어요.

 

 

이건 지난번 만들었을때사진입니다.

시약스푼으로 잘 저어주고, 핫플레이트에 끓여주었던 모습이요.

시험장에 준비된 준비물을 보고 잘 만들어봐야겠습니다.

보통은 끓이는 과정 없이 그냥 고압멸균기에 넣는다고들 하더군요.

(어짜피 그 안에서 끓을테니..)

 

뜨겁네요ㅠ

조심조심 꺼내주었습니다.

 

무균상 이용하기 전에!

손과 팔을 소독해요.

70% 알코올 수용액이 담긴 스프레이가 있을꺼에요.

 

장갑 또는 맨손을 스프레이로 다 뿌리고, 팔과 손목 등등 다 뿌려요.

 

무균상도 사용전 2시간동안 자외선등을 켜놓고, 내부를 에탄올로 다 뿌리고, 닦고 해두며

사용전에는 자외선등을 끄고, 환기팬을 작동시키고, 작업등을 켭니다.

 

피펫을 이용해서

(그런데.. 피펫이 자동피펫이 있을지, 수동피펫이 있을지..어떨지 모르겠다는게 함정입니다.)

시험관에 넣어주는데요.

저는 사진찍을라고 시험관을 안들어주었는데요.

오른손으로 피펫을 들고, 왼손으로는 시험관을 기울여서 넣어주면 됩니다.

그런데 시험관 벽에 배지가 안묻게 넣으라는데 아이구..ㅠ

이게 계속 묻어요 어흑흑흑..

어짜피 고압멸균할때 다 씻겨서 내려간다는데...

시험장에서는 어쩌나 스트레스 받습니다.

가장 주의할 것은 면전이 들어갈 입구에 배지가 안묻게 하는것이겠지요.

하아.. 맘에 안드는 분주입니다.

분주량이 10~15ml라는 것도 기억. 시험관 1/3정도 됩니다.

(뒤에 보이는 작은 시험관이 미생물실험실에서 얻어온 PDA 사면배지에요)

 

 

면전하는 모습을 찍은게 또 없어서..

지난날 면전 연습한 사진입니다.

책에는 솜을 몇장 겹쳐서 중심에 심을 만들어주고, 돌돌 말고.. 그런게 나오는데

버섯연구소에서 장기간 일하셨던 선생님께 직접 배운..면전..ㅋㅋ

도리돌돌 말아서 반을 접어 매끈하게 겉을 만들고, 꾸아아아악 맞게 끼우면 끝.

그런데 면전이 나오기보다는 실리스토퍼가 있을꺼라고...

일명 "쏘세지"를 한손에 잡고, 시험관을 다른 손에 잡고

돌려가면서 끼우고, 주름잡힌 부분이 없도로 반대로 살짝 돌려주면 끝.

 

시험관이 잡아빼봐서 쏙! 안빠지면 될 것 같습니다.

전체를 호일로 덮어도 되고, 개별로 덮어도 되는데

모양은 개별로 덮은게 더 이뻐요.

아무튼 고압멸균기 철제바구니에 잘 담고...

 

(요건 또 지난날 삼각플라스크)

 

고압멸균기 사용방법 포스팅을 했었지만 한번 더 반복합니다.

일단 통안에 물이 있는지 확인하기.

없으면 물을 부어주기.

열선이 잠길정도 넣어줍니다.

받침대를 넣어주고,

바구니를 넣어주구요.

뚜껑을 덮는데 시계방향으로 꾸아아악 잠궈 김이 안새게 합니다.

(아 시험장에는 귀걸이, 목걸이, 반지, 시계 등등 악세서리는 모두 빼고갑니다.)

SET버튼을 누르면 온도와 시간을 조절할 수 있어요.

오토클래이브 종류별로 조작버튼이 다르니까ㅠ

시험장에서 눈치껏 잘하셔야 할 듯 합니다.

 

중요한건 온도는 121도.

시간은 21분(교재에 따라 20분이라고 되어있기도 해요.)

압력은 1.1~1.2kg/cm2

 

저는 21분으로 맞춰주었어요.

배기밸브는 미리 잠궈주는게 좋습니다.

(미리 잠그는 경우에는 108도 부근에서 8~10분간 열었다가 다시 잠궈줍니다.)

아니면 열어놓았다가 108도가 되면 잠궈줍니다.

 

그런다음 start버튼을 꾸우우우욱 오래 누르고 있으면 시작!

온도가 겁나게 빨리 올라가더군요.

 

저는 배기밸브를 미리 잠궈서 시작했다가 108도 부근에서 잠시 수증기를 빼주고,

다시 잠가주었습니다.

 

그리고 121도가 된 후부터 21분을 따로 시계를 보고 재어주었어요.

이 기계가 설정온도부터 시간을 재어서 멈추는건지 잘 모르겠어서요.

압력게이지도 1.1이 되는 것을 확인했습니다.

그런다음 stop버튼을 눌러서 꺼주었어요.

책에는 배기밸브를 살짝 열어주라고 되어있는데

이 기계는 자동으로 자기가 수증기를 빼더라구요!

 

 

배기밸브를 풀어주구요.

(그랬더니 뒤 수증기배출구에서 김이 푸시익~~~)

100도 이하로 온도가 내려간 것을 확인하고(또는 압력게이지에 0)

뚜껑을 열어줍니다.



반시계방향으로 돌려서 열었어요.



따끈따끈하게 잘 익었습니다.쿄쿄.

시험관 내벽에 덕지덕지 묻은 배지도 깔끔하게 씻겨 내려갔구요.

 

무균상(크린벤치)에 기울여서 넣어주었습니다.

받침대가 저희는 따로 없어서..ㅠ 보통은 주르르르~ 늘어놓는 받침대가 있어요.

다시 피펫을 이용해서,

(무균상을 드나들때마다 다시 에탄올 스프레이로 손과 팔을 막 뿌려줍니다.)

샤레, 페트리디쉬에 분주를 해줍니다.

20ml씩이요.

혹시 그냥 스포이드가 주어진다면, 눈으로 봐서 페트리디쉬에 찰랑찰랑할정도면 된다고 합니다.

 

 

그리고는 뚜껑에 물방울이 안맺히게.. 살짝 열어서 식혀줍니다