버섯종균기능사 실기 시험에 임하는 자세와 준비
버섯종균기능사 실기 시험에 임하는 자세와 준비
: 실기시험에서 테스트하는 과정은 버섯의 생장과 배양 및
균사를 다루는 작업 배지에 대한 기본 지식과 실무의 유무를
확인하는 단계라 생각한다
: 각 단계의 시험에서 시험관의 요구사항을 받으면 잠시 자신의
작업할 동선을 미리 생각하고 세팅하는 것이 중요하다
1)버섯이식 작업 및 포자채취
1 준비 사항
1) 매 행동마다 소독과 화염살균을 하겠다는 마음가짐
2) 크린밴치 내부에 시험 재료 비치 확인.
준비 재료 (시험관 원균, 시험관 새배지, 샤레 , 버섯, 파라필름.네임펜유무 확인)
3) 크린밴치 착석 후 손 소독. (크린밴치 외부에서 소독수 분무)
4) 크린밴치 내부에서 손 건조.
5) 크린밴치 정리 및 세팅 (소독수 분무 후 휴지로 닦을것.)
6) 화염 소독기에 불 붙이기.
7} 조직 분리용 버섯 소독. 갓부위를 화염살균
8) 시험기구 화염 소독 후 거치대에 거치. (백금구, 메스, 거치대, 받침대-이쑤시게) 등.
9) 작엄후 반드시 정리정돈 할 것
2 포자수집
1) 빈 샤레와 버섯 받침대 준비.
2) 샤레 뚜껑을 열고 버섯 받침대 2개를 화염 소독 후 샤레에 올리기.
3) 메스 화염 소독 후 냉각.(사용하지 않을 부위에 냉각)
4) 버섯갓 절단.(절단하면서 샤례위를 지나지 않게 조심하며 오염되거나 바닦에
떨어지지 않도록 주의)
5) 절단 후 버섯 갓을 받침대에 올리고 샤레 뚜껑 덮기.
6) 종이 꼬깔로 샤레 전체를 덮기.반드시 정리정돈 후 끝내기
3 조직 분리
1) 샤레 새배지에 밀봉이 되어 있으면 밀봉된 비닐 제거 후 샤례 화염살균
2) 소독한 버섯을 가운데 절단.버섯 절단 후에는 절단면이 오염되지 않도록 주의.
3) 메스 소독 후 조직 분리.(조직 크기는 3mm x 3mm x 2mm)
4) 버섯을 바닦에 오염되지 않도록 내려 놓고 백금구 화염 소독.
5) 새배지 샤레를 열고 가장자리에서 백금구 냉각 후 샤레 뚜겅 닫기.
6) 버섯을 왼손으로 잡고 백금구로 분리된 버섯 조직을 집어서 새배지 중앙에 조직 이식.
7) 비치된 파라필름 밀봉.(이식된 버섯 조직이 움직이지 않게 평행을 유지)
4 계대 배양(시험관 이식)
1) 왼손으로 시험관 원균과 시험관 새배지를 잡고 화염 소독.
2) 시험관 원균 및 새배지 실리스토퍼를 열고 화염 소독.(시험관입구,실리스토퍼,백금구)
3) 백금구 화염소독 손잡이까지 화염 소독 후 새배지 가장자리에 냉각.
4) 시험관 원균에서 균 절단.(3mm x 3mm x 2mm)
5) 분리된 원균을 백금구로 집어서 시험관 새배지 중앙에 이식.(원균 면이 위쪽)
6) 시험관 원균 및 새배지 그리고 실리스토퍼를 화염 소독 후 시험관 새배지 부터 닫는다.
7) 시험관 입구 실리스토퍼에 주름을 펴주고 화염 소독.
8) 시험 기구를 화염 소독 후 화염 소독기 불을 끈다.
9) 균주 번호와 계대 배양 날짜 등을 네임팬으로 기록.
10) 크린밴치 내부에 소독수를 분무하여 휴지로 청소 한다
2)소독제 및 배지제조
1 에탄올 소독수 제조
1) 소독수 제조 비율 = 알코올(7) : 증류수(3)
에탄올농도 100%가 아닐경우
요구용액농도 / 원액농도 x 요구부피 = 첨가부피
2 고체 배지 제조(P.D.A) 1000ml 일때 P.D.A 39g
감자 배지 (Potato Dextrose Agar)
ex) P.D.A를 이용하여 배지 200ml 제조일경우.
1) 저울을 켠후 유산지를 대각 방향으로 접은후 펼쳐준다.(저울가장자리에 닿지않게)
2) 저울에 유산지를 올려놓고 영점을 다시 세팅한다.
3) P.D.A 7.9g(원하는부피 x pda39g)를 측정하여 원형 플라스크에 담는다.
4) 메스 실린더에 증류수 200ml를 측정하여 P.D.A가 들어있는 원형 플라스크에 담는다.
5) 원형 플라스크 내부의 P.D.A와 증류수가 섞일 수 있도록 긴 시양스픈등으로 저어준다.
6) 가열 기구에 원형 플라스크를 한천이 녹아서 투명해질때까지(60℃에서 녹음) 가열한다.
가스랜지로 가열시 약 2분 / 전자레인지로 가열시 30~40초
7) 한천이 투명해지면 가열을 멈추고 원형 플라스크를 내려 놓는다
이때 원형 플라스크가 뜨거우니 조심해야하며, 장갑등을 이용하여 옮긴다.
8) 원형 플라스크 입구를 실리스토퍼로 밀봉 한다.
이때 실리스토퍼에 생긴 주름을 펴줘야 하며, 입구 밀봉 후에는 호일로 다시 감싸준다.
9) 원형 플라스크를 들고 고압 살균기로 이동.
시험관을 준비한 후 피펫을 이용하여 시험관 1개에 15ml 씩 주입한다.
만약 시험관을 이용한 60ml 제조일 경우 시험관 4개를 제조한다.
시험관 제조가 끝나면 입구를 실리스토퍼를 사용하여 밀봉한 후 알루미늄 호일로 감싸준다.
(실리스토퍼에 생긴 주름을 펴줘야함.)
시험관을 들고 고압 살균기로 이동.
시험관배지 제조일 경우 고압 살균후에는 사면한다.(기울어서 보관)
3 액체 배지 제조(P.D.B) 1000ml 일때 P.D.B 24g
1) 액체 제조 과정은 고체 배지 제조(P.D.A)와 같으며, 가열만 생략하고 진행하면 된다.
2) 액체 배지 제조 할 때에는 삼각 플라스크를 사용하여도 무방.(가열이 없기 때문)
3) 제조가 끝나면 플라스크를 들고 고압 살균기로 이동.
가) 감자한천배지
감자로 끓여서 만드는 방법 또는 PDA 39g으로 만드는 두가지가 있다
감자 200g 데트록스 20g 아가 20g
씨눈을 제거한 감자는 사방 1cm크기로 깍둑썰기를 하여 200g을 계량하고
물1,000ml를 정확하게 계량한후 끓인다 계량시 눈 높이에 주위한다
거름종이나 헝겊을 사용하여 계량할수 있는 컵이나 비이커에 감자입자를 제거후
데트록스와 한천을 넣고 1,000ml가 되도록 물을 보충한 후 한천이 녹을때까지
끓이는데 반드시 시약스푼으로 잘져어야 한다
한천이 녹으면 1,000ml 비이커에 계량하여 물을 보충한다
고압살균 20~30분간을 하는데 분주한 시험관(15~20ml) 비이커(1/3)에 호일로
감싸는 것을 잊으면 안된다.
다) 맥아배지 조제법
맥아 추출물 200g 펩톤 5g 한천 20g 증류수 1,000ml
(감자 한천배지 조제와 같다)
라) 퇴비 추출배지 조제법
양송이 건조퇴비 40g 맥아추출물 7g 데트록스 10g 한천 20g 증류수 1,000ml
마) 참나무 톱밥 추출배지 조제법
참나무톱밥 200g 데트록스 20g 맥아추출물 3g 한천 20g 증류수 1,000ml
3. 고압살균 방법.
가) 액체배지는 20~30분 고체배지는 60~90분간 고압 살균한다
나) 고압살균을 할때 뚜껑을 열고 물의 양을 확인하고 옆에 배수구와 앞면의 배기
밸브가 잠겨있는지 확인한다
다) 배지는 반드시 호일로 쌓서 넣는다
라) 온도와 시간을 맞춘다
(대부분 고압살균기의 압력은 온도와 시간에 따라 자동 세팅된다)
마) 108도에 도달 했을 때 5분정도 배기 밸브를 조금 열어 놓는다
바) 5분후 배기 밸브를 잠그고 살균이 완료되기까지 기다린다.
사) 살균 완료시 가능한 자연배기가 되도록 하고 기압이 0기압이 되고 온도가 70℃에서 뚜껑을 열어도 된다
아) 살균된 배지를 즉시 무균상에 옮긴다
자) 살균기 뒷정리를 깔끔하게 한다.
4. 알콜 소독제 70% 만들기.
에틸알콜은 순도 100%는 단백질 응고작용이 있어 주로 사용하는 알콜순도는 95%로
사용합니다
가) 95% 알콜로 70% 소독제 만드는 방법
원하는 농도 / 현재용액의 농도 x 최종부피 = 첨가할 부피
95%농도 에탄올로 70% 소독제만들기
1,000ml 일 경우 70% / 95 x 1,000ml = 알콜 737ml +물 263ml
500ml 일 경우 70% / 95 x 500ml = 알콜 369ml +물 131ml
250ml 일 경우 70% / 95 x 250ml = 알콜 185ml +물 65ml
5. 톱밥배지 제조
가) 버섯 종류별 배지제조를 요구할 경우를 대비한다
느타리 → 포플러톱밥 80% : 미강 20%
표고 → 참나무톱밥 80% : 미강 20%
팽이 → 버드나무 또는 느티나무톱밥 80% : 20%
버들송이→ 소나무톱밥 70% : 미강 30%
노루궁뎅이 → 참나무 40% : 포플러 40% : 미강 20%
목이 → 버드나무 25% : 참나무 65% : 미강 15%
영지 → 졸참나무 80% : 미강 20%
나) 톱밥배지 비율
1,000ml병에 톱밥배지 제조일경우 수분함량 65%로 만들려면
표고 . 느타리 톱밥 80% : 미강 20%
톱밥 600g + 미강 150g + 물 300ml
500ml병에 톱밥배지 제조일경우 수분함량 65%로 만들려면
표고 . 느타리 톱밥 80% : 미강 20%
톱밥 300g + 미강 75g + 물 150ml
250ml병에 톱밥배지 제조일경우 수분함량 65%로 만들려면
표고 . 느타리 톱밥 80% : 미강 20%
톱밥 150g + 미강 38g + 물 75ml
6. 곡립배지 제조
가) 배합비율 밀(삶은밀)1,000g + 황산칼슘(석고.결착방지) 20g + 탄산칼슘 10g(ph)
나) 솥에 밀을 넣고 밀이 잠길정도 물을 붓고 끓인다
삶는 과정에서 밀이 타지 않도록 계속 져어준다
다) 밀을 꺼내어 횡으로 절단 하였을 때 1~2mm정도 백색부분이 남아있고 외부가
투명할 때 가열을 중지한다 ( 완전히 삶으면 전분이 노출되어 덩어리가 생긴다)
라) 삶은 밀에 바람을 가하여 물기를 제거한다
마) 무게를 계량하여 1,000g에 석고 20g 탄산칼슘 10g을 섞는디
바) 1,000cc에 454g 약 2/3담는다.
4 고압 살균기 사용 방법 (오토 클래이브)
오토클레이브 작업전 반드시 배수 밸브를 확인후 배기밸브를 잠근다
1) 손잡이를 돌려 고압 살균기 뚜껑을 연다.
2) 고압 살균기 내부에서 바구니를 꺼낸다.
3) 고압 살균기 내부 물높이 확인.(물 높이 양은 내부 철망이 잠길듯 말듯한 높이)
물높이 확인 물 부족시 증류수(증류수 없을시 물)를 보충하고, 물이 많을경우 하부 밸브를
열어 배수를 한다.
4) 바구니에 고압 살균할 배지를 담는다.호일로 전체적으로 덮는다
5) 바구니를 고압 살균기에 넣고 고압 살균기 뚜껑을 닫는다.
6) 배기 밸브를 잠근 후 약간 열어준다.또는 108℃에서 약간 열어준 후 5~10분후 닫는다
7) 고압 살균이 끝나면 바구니를 꺼내어 테이블에 거치.
8) 시험관 고체 배지 제조일 경우 시험관 사면 보관 할것.