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배양실험
1. 정치배양법
각 종 플라스크 또는 병 안에 액체배지로 균사체를 배양하기 위하여 배양용기를 선반 등에 움직이지 않게 놓아서 배양하는 방법이다. 배양액에서 생육한 균사체와 배양여액에 관한 시험재료로 쓰기 위하여 사용한다.
1) 액체배지를 조제해 배양용기에 분주한다. 그 액량은 100ml들이 플라스크의 경우 20～50ml가 적량이고 너무 많으면 균사발육이 늦어지거나 균체와 또는 균체에서 분비된 대사산물의 수율이 낮아진다. 배지조성은 정치배양이라고 하여 특별한 것은 아니며 광시균주의 균사체증식에 적합한 액체배지가 있다면 어느 것이라도 좋다.
2) 면전을 한 후 고압 멸균한다.
3) 균사체를 액체배지에 접종한다. 접종하는 균사체는 사면배지에서 배양한 것도 좋으나 미리 평판배지에 배양한 colony 주변부를 멸균한 cork borer로 떼어내어 그 균사체 원판을 배지표면에 접종한다.
4) 정밀한 시험을 할 때는 동일기간, 배지로 배양한 균사체편을 일정량 접종하지 않으면 안되기 때문에 평판배지의 colony를 사용한다. 배지조성 또는 시험목적에 성분의 일부를 별도 플라스크에 멸균하든가 membrane filter로 여과멸균하여 접종직전에 혼합한다. 당류는 별도로 멸균한 편이 좋다.
5) 접종한 배양용기를 움직이지 않고 항온배양기나 배양실의 선반에 놓고 배양한다. 배양 중에는 배양용기가 움직이지 않도록 한다. 특히 배양중에 배양여액을 채취하려고 할 때는 생육한 균사체의 표면에 배양액이 묻지 않도록 주의한다. 균사체의 표면이 빠지면 그 후 균사 생육이 저해 되어 자실체 형성실험을 할 때 현저히 저해되는 경우가 많다.
6) 배양중에 배양여액을 시료로 채취할 때는 꼭지달린 삼각플라스크나 시료 채취용 플라스크가 적당하며 배양중 시료 채취구의 오염에 주의한다.
7) 다량의 균사체를 얻고자 할 때는 L자형, 또는 ㄷ 자형의 배양병을 사용하는 편이 배지 표면적이 커저 적당하며 배양병 이동시 면전이 빠지지 않도록 주의한다.
8) 배양기간이 긴 경우는 면전보다도 실리콘마개의 편이 좋으며 균사체 생장 curve는 균주에 따라 다르나 안정기에 달하면 그 이상 증식하지 않기 때문에 균사체를 목적으로 할 때는 그 curve에 의하여 배양기간을 결정한다.
2. 진탕배양법
각종 액체배지에 균사체를 배양하기 위하여 배양용기를 고정한 후 왕복진탕 또는 회전진탕하여 배양하는 방법이다. 이 배양은 균사체와 대사산물을 소량 생산할 때, 폭기장치에 의한 균사체 대량배양 생산할 때, 종균배양에 적용될 수 있다.
1) 액체배지를 만들어서 삼각플라스크에 분주한다. 주입되는 액체량은 500ml용 플라스크의 경우
150ml～200ml가 적당하다.
2) 면전을 실히 한 후 고압멸균한다.
3) 정치(또는 진탕)배양한 균사체를 미리 멸균한 균질기(homogenisers)의 컵에 옮겨, 약 10분간 균질기를
작동하여 균사체가 균일하게 마쇄 되도록 한다.
4) 균일하게 균질한 균사체를 미리 멸균한 피펫으로 10～30ml 접종한다.
5) 배양실 또는 배양기 내에 설치한 진탕 배양장치에 플라스크를 고정해 60～120rpm으로 왕복진탕 또는 100～300rpm으로 회전진탕에 의해 배양한다. 최적 진탕수는 균주에 따라 최적조건이 달라지기 때문에 문헌을 조사하던가 시험을 하여 결정한다. 배양 중에 배양액이 진탕에 의하여 플라스크 내면에 부착해 그 속에 균사가 증식되는 경우가 있다. 그럴 때는 진탕장치를 멈춰서 멸균한 유리봉으로 배양액중에 균사를 떨어뜨릴 필요가 있다.
6) 배지의 조성은 공시 균주의 균사체 증식에 적합한 것을 이용한다. 균주에 따라 배지의 점성이 약간 높으면 균사증식이 좋은 경우가 있다. 그럴 때는 배지 중에 Carboxymethyl cellulose(CMC)와 계면활성제 등을 소량 첨가하는 것이 좋다.
7) 균사체를 균질기로 갈 때 뚜껑 주위에 얼음물을 넣어 온도 상승을 억제 한다.
8) 실험목적에 따라 사면 또는 평판배지에 배양한 균사체편을 5～6편 정도 접종하여도 좋다. 또 목재부후균의 경우 40메쉬 이하의 가는 나무조각 배지에 균사를 배양해 그것을 배지와 함께 10～30g 접종한는 것도 가능하다.
9) 진탕배양하면 균사체는 보통 구상의 균사 펠렛 또는 섬유상 균사체가 되어 증식 된다. 어느 타입이 되는가는 균주, 배지 진탕조건에 EK라 서로 다르다. 균사체가 구형이 되면 증식이 저하되고 동일조건에 배양하여도 플라스크에 따라 균체량이 달라진다. 섬유상 균사체가 가장 증식이 빠르기 때문에 그와 같은 조건이 되도록 배양조건을 만들어 준다. 배지에 약간 점성을 주면 펠렛의 크기가 적게되고 증식도 잘된다.
10) 균주 배양중에 배양액의 점성이 현저히 놓아 진탕효과가 저하하는 경우, 배지조성 특히 당의 종류와 무기질소의 형태를 변경하면 억제되는 경우도 있다.
11) 균주에 따라 진탕배양을 하면 균의 성상이 현저히 변하는 경우가 있어 맛버섯은 그 전형적이 예로 2핵균사를 접종해도 증식한 균사는 1핵균사가 된다. 따라서 이러한 균주를 진탕배양 할 때 주의를 요한다.
⑥ 진탕배양 장치에 플라스크를 설치하여 진탕배양한다